胶质细胞源性神经营养因子与面神经损伤及再生的研究进展
口腔颌面外科杂志2006年12月第16卷第4期
陈蕾，许海凤(综述) 李蜀光 (审校)
1．广东医学院口腔颌面外科，广东湛江
2．佛山市第二人民医院口腔颌面外科，广东佛山
基金项目：广东省医学科学技术研究基金资助(B2003144)
[关键词]胶质细胞源性神经营养因子；面神经；再生
面神经损伤是常见的颌面外科疾患。目前的治疗多强调手术修复技巧。自体神经移植被视为黄金手段。尽管显微外科和神经科学不断发展，修复技术几乎达到尽善尽美的程度．但临床上我们常见到术后神经功能的恢复并不理想。人们发现神经元胞体的调控和再生微环境的营养和导向对受损神经的有效再生具有重要作用。应用外源性神经营养因子促进神经再生成为目前研究热点之一。而胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line—derived neurotropic factor。GDNF)则是现在发现的活性最强的运动神经元神经营养因子．本文就GDNF与面神经损伤及再生的研究现状作一综述。
1 GDNF的研究现状
GDNF是近年来发现的一种新的神经营养因子．1993年6月。美国Synergen生物技术公司的Lin等成功发现并克隆了GDNF。它是转化生长因子一B(transforming growth factor—p，TGF一13)超家族成员，最初认为它是一种较特异的多巴胺(dopamine，DA)能神经营养因子．现认为它能特异作用于胆碱能运动神经元．实验证明GDNF不仅促进正常运动神经元的存活。降低细胞凋亡中自然发生的神经元死亡。还对受损的运动神经元具有营养保护作用。研究发现GDNF对运动神经元的保护作用比脑源性神经营养因子(brain—derived neurotropic factor，BDNF)高75倍。比睫状神经营养因子高650倍，是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子。
2 面神经损伤后内源性GDNF及其受体的改变
2．1 内源性GDNF的改变
GDNF的mRNA在正常面神经元中通常表现为低水平的表达，其作用在于：(1)发挥其营养作用，维持神经元细胞的形态和功能；(2)行使信号监控作用。此即GDNF的信号，营养系统。当神经受损后此系统被激活，王琛等[21建立家兔面神经撞击伤模型。撞击后3、7、14、21 d采用原位杂交法分别检测面神经元及周围神经中GDNFmRNA的表达．结果不同时间点均可检出强烈的GDNFmRNA表达。第7天达高峰，随后逐渐下降，至第2l天仍有较高水平表达。表明GDNFmRNA表达高峰在面神经损伤的早期，这与轴突的再生过程相一致。即GDNF是一种应激性表达升高的因子．在面神经损伤的早期发挥营养保护作用，一方面面神经元中的GDNF的合成作用加强，使其发挥对神经元的营养作用。减少神经元的死亡数量：另一方面GDNF可促进神经元内物质的合成，有利于损伤神经的再生。当神经损伤达稳定阶段。GDNF即下调其表达强度，但仍维持在一个合理的水平上发挥作用。
2．2 GDNF受体的改变
GDNF的神经营养作用主要是通过其两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体
(glial cell line—derived neurotropic factor receptors— ，GFRots)亚基和受体酪氨酸激酶Ret亚基。Burazin等[31利用成年大鼠面神经切断及钳夹两种模型．研究GDNF受体mRNA在面神经元内的变化，结果受体酪氨酸激酶Ret亚基的mRNA在面神经切断及钳
夹后1～3 d内其水平升至1．4倍，7～21 d恢复正常：GFR 的mRNA在面神经钳夹后1～3 d上升至2～3倍．面神经切断后GFRot的mRNA上调时间可达21 d，而上调幅度与钳夹伤相似。说明受体mRNA的表达上调时间与神经损伤程度成正比．实验还发现受体在神经损伤后21 d的恢复过程与轴突的恢复过程是一致的。
3 外源性GDNF对面神经损伤后再生的作用
面神经损伤后再生的先决条件是神经元胞体的存活和轴突的延伸。而面神经受损后逆向运输神经营养因子出现障碍．会导致神经细胞死亡和再生功能丧失，而如果神经元的逆向生长转为由周围靶器官来源的神经营养因子来支持，这个过程将被矫正。因此外源性GDNF对受伤神经微环境的调节可能起到与靶器官神经再生支配相同的效果，这对临床治疗有指导意义。Barras等 在对大鼠面神经切断的动物模型研究中发现．应用GDNF有髓神经纤维长人8 mm长的断裂缺损沟，如不加入GDNF，这个距离不可能允许神经再生。
3．1 对面运动神经元的保护作用
Yan等[5]报道切断新生鼠的面神经后90％的神经元细胞死亡，给予GDNF治疗后，7 d内近100％面神经元存活，而对照组仅6％存活．显见GDNF提高了面神经元的存活率。Sakamoto等{61在面神经撕脱伤的动物模型中，分别应用了以腺病毒为载体的GDNF、IGF．1(insulin．1ike growth factor 1)、TGF．132等转染，结果发现GDNF等能明显提高乙酰胆碱转移酶的活性，抑制NO合酶的诱导作用(NO是神经毒性气体，参与轴突切断引起的神经元死亡)减少面神经元变性。Hottinger等[71制作了一种特殊的面神经损伤动物模型，模型中50％面神经元逐渐地、一致性地丧失和萎缩：实验前给予GDNF并在1个月后，再进行面神经切断。结果95％的面神经元完好存活，该研究提示神经营养因子对成年后发生的面神经元损伤具有保护作用。GDNF还可以完全防止损伤造成的神经元萎缩，这在神经营养因子家族中还没有发现过。Oppenheim~ l的研究甚至发现受损神经接受GDNF后．神经元细胞胞体不但不萎缩．反而肥大了，这可能是受损细胞对GDNF产生过反应所致。
3．2 促轴突再生作用
王琛等 和Chen等[10]通过建立神经缺损动物模型，并以硅胶管／胶原管内注射GDNF套接缝合修复，不同时间取材，图像分析测量再生轴突直径及单位面积轴突数量，再生轴突恢复率，电镜观察轴突及髓鞘超微结构并测定神经传导速度，发现GDNF组在有髓鞘轴突再生数量、轴突恢复率、神经传导速度及形态学上的恢复都优于对照组。外源性GDNF的应用提高了轴突再生的数量和质量．再生轴突以更快的速度进入靶肌肉与之建立功能联系，促进神经元细胞的生长及分化，而神经元细胞的生长和分化又反过来加速了轴突的再生速度，两者相互促进。在面神经修复中常因轴突的侧副分支，错向再生导致肌肉运动不协调，功能恢复不良。外源性GDNF促面神经受损后的轴突再生，那么反之，近年有学者研究用GDNF抗体来抑制轴突的侧副分支．消除错误导向，使面神经损伤的修复更为精准⋯～31，但其对面神经功能恢复的效果评价不一。
4 GDNF的给药方式
GDNF是大分子蛋白，半衰期短．难以通过血脑屏障，用药方式的困难限制了它步入临床的步伐，至今对于面神经损伤中GDNF的给药方式仍在不断的摸索之中。
4．1 全身用药
包括静脉、肌肉及皮下注射，此途径临床使用较方便，但GDNF在神经系统外作用不清．缺乏足够的药代动力学资料。且血浆GDNF浓度降低较快．同时真正到达胞体及受损神经的量较小，注射需要量大，副作用明显，还可能产生抗体。
4．2 局部用药
局部注射可形成局部高浓度．有利于神经元的存活，是目前最常用的给药方式，但在实际应用中存在给药安全等问题，剂量过大可产生毒副作用，剂量小则达不到治疗效果。将外源性GDNF注射于损伤神经局部定位困难且被周围组织吸收，一次给药后很快降解，多次给药创伤大易感染。将外源性GDNF注入神经再生室损伤神经的断端也是常用的方法，但GDNF易从再生室管腔两端微小的间隙漏出，作用时间较短，加之材料本身降解，生物利用度不高。也有研究使用微泵装置将GDNF长期定量注入，可以克服一次性给药不足，起到持久的神经营养作用，但由于装置较复杂，使用不便，难于广泛用于临床。蛛网膜下腔注射，外源性GDNF易于被神经元摄取，而发挥保护神经元作用，不足是GDNF不能到达神经损伤部位，且给予方法相对困难。
4．3 基因治疗
转基因是将GDNF目的基因通过载体导人受损面神经靶细胞使目的基因持续表达，可提供长期而有效的GDNF的释放，可避免重组蛋白应用半衰期短，需反复追加易引起感染的不利因素。目前转染方式有：(1)活体直接转移，用载体介导的GDNF基因直接注射；(2)回体转移，GDNF基因导人纤维母细胞或雪旺细胞等受体细胞，体外培养后植入神经损伤处。Watabe等在成年大鼠撕脱伤的面神经神经元中转导腺病毒编码GDNF、BDNF、TGF．132， 检测其神经保护作用，结果表明腺病毒介导的GDNF基因转导用于防止面神经损伤后神经元退行性变是可行而合理的选择。但基因治疗刚刚起步，许多技术上的问题有待发展和成熟。目前的转基因治疗大多通过病毒作载体，但病毒对导人的基因大小有一定限制，且具有抗原性，临床应用有一定的危险性。
5 问题和展望
综上，对于面神经损伤我们不仅要充分运用显微外科操作技巧，更要着重于创造良好的再生微环境。目前GDNF对面神经受损后的再生保护作用及可能的临床应用有很多研究，但仍存在很多问题有待进一步解决：
(1)面神经损伤后GDNF保护神经元和促进轴突再生的作用机制还不清楚，是什么启动GDNF表达不同损伤形式下GDNF的反应相同吗?
(2)外源性GDNF作为药物其安全性尚需进一步评价，药物副作用又怎样?如Jubran等 指出GDNF加速神经感觉恢复的同时，会增加治疗后神经性疼痛发生的程度，影响功能恢复。GDNF的抗原性引起免疫反应等该如何设法减少和避免
(3)还没有找到稳定的给药方式，随着分子生物学技术的发展，转基因治疗成为最有前景的治疗手段之一， 目前需要解决的问题是获得安全性好的，可在组织内特异性表达的或可诱导基因表达的新型载体来代替现有的病毒性载体。
(4)GDNF与其它各种神经营养因子对面神经损伤的修复作用具有交叉性和协同性，联合用药可提高疗效，但有无药物配伍禁忌尚不得而知，因此尚需进行积极而慎重的药理学研究。
目前外源性GDNF提高面神经损伤后神经修复效果已得到众多实验研究的证实，我们相信随着GDNF研究的进一步深入，面神经等周围运动神经损伤后的修复治疗会增加一种新的手段。
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