中华实验外科杂志2006年9月第23卷笫9期
北京大学深圳医院手外科(肖颖锋、万圣祥)
华中科技大学同济医学院(洪光祥、罗永湘)
【摘要】 目的 研究周围神经损伤、神经再生及外源性神经生长因子对脊神经背根神经节中TrkA及TrkA mRNA表达的影响。方法 将24只SD大鼠坐骨神经从神经中段切断后，外膜缝合修复神经。实验组动物的胫后肌内每日注射NGF 200 U，术后3、7、14、28 d，采用免疫组织化学及原位杂交方法，检查大鼠坐骨神经损伤、神经再生及外源性NGF靶肌肉注射后脊神经背根神经节中TrkA及TrkA mRNA表达。结果 正常背根神经节中有大量的神经元表达TrkA及TrkA mR—NA；坐骨神经损伤后，背根神经节中TrkA 的表达下降，术后7 d组最低，28 d接近正常；NGF靶肌肉注射后，背根神经节中TrkA的表达明显增高。结论 神经损伤后背根神经节中TrkA 的表达降低，靶肌肉注射外源性NGF背根神经节中TrkA 的表达增加，表明靶肌肉注射可作为NGF的有效给药途径。
【关键词】坐骨神经； 背根神经节； 神经生长因子； 基因表达
神经生长因子(NGF)具有促进中枢及外周神经系统中某些神经元的存活、分化、促进损伤神经的轴突再生、防止细胞坏死的功能。神经损伤后局部及脑室内注射神经生长因子，能引起神经生长因子低亲合性受体p75NGFR及高亲合性受体TrkA表达的改变，但从损伤神经所支配的靶肌肉注射NGF能否引起相应背根神经节中TrkA表达的变化报道尚少。我们设计本研究，旨在探讨坐骨神经损伤，神经再生及应用NGF靶肌肉注射对神经生长因子高亲合性受体Trl表达的影响。
材料与方法
实验研究·
1．动物模型的建立：成年雄性SD大鼠24只，体重为200～250 g，随机分为两组，每组12只，用0．3％异戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉，在左大腿中部后侧作切口，显露坐骨神经，从其中段切断后用外膜缝合法修复神经，缝合切口，分笼饲养，其中实验组动物胫后肌内每日注射NGF 200 U，单纯手术组作为对照组，两组动物分别于术后3、7、14、28 d各取3只动物，切取IA、L5背根神经节，储存于一i96℃ 液氮中待检查。另取3只正常大鼠的背根神经节作为正常对照。
2．免疫组织化学检查：标本用一20℃ 冰冻切片机切片，组织片厚10／zm，用4％的多聚甲醛固定15 min后自然干燥，采用LSAB法进行免疫组织化学染色，TrkA兔抗鼠多抗为Santa Cruz Biotechnology公司产品，简要操作步骤如下：(1)切片用3％的H2o2甲醇液封闭15 min。(2)磷酸盐缓冲液(PBS)洗后10％ 牛血清蛋白封闭15 min。(3)加入TrkA兔抗鼠一抗(1：100)37℃ ，3 min。(4)PBS洗后加入生物素化的羊抗兔IgG(1：200)37℃ ，30 min。(5)PBS洗后加入HRP标记的链霉亲合素37℃ ，20 min。(6)DAB／H202显色。(7)常规脱水，透明，中性树胶封固后显微镜下观察TrkA阳性表达情况，阴性对照片用PBS代替一抗培养，其余操作步骤相同。
3．原位杂交组织化学检查：(1)合成及标记寡核苷酸链探针：TrkA探针为针对鼠Trl mRNA的反义寡核苷酸链，此段序列与人TrkA mRNA位于跨膜区及第2免疫球蛋白区1198—1245碱基对之间的序列互补，此段寡核苷酸链探针的序列为5’一AAG．GTTCAACTCAA A AGGGTTGTCCATCA AGGCAGCATGATGGAGGC一3’。所合成的寡核苷酸链探针采用Boehrringer Mannheim公司的地高辛寡核苷酸加尾标记试剂盒标记，方法按试剂盒所附的标记方法完成。
(2)原位杂交组织化学染色：采用Boehrringer Mannheim公司推荐的寡核苷酸链原位杂交组织化学方法进行组织切片的原位杂交过程(具体步骤略)，阴性对照采用不含探针的杂交液代替杂交液进行反应。采用免疫组织化学染色作阳性对照。
4．组织切片的图像分析：将免疫组织化学染色切片用MPIAS，500多媒体彩色图像分析系统进行测量，测量窗大小为1．751 2×10 m2。每张组织片随机选用20个细胞，每组动物共60个细胞，测定其平均吸光度值(A值)。A值越大，TrkA蛋白的相对含量越高。
5．统计学方法：对各组之间的A 值应用t检验。
结 果
1．正常背根神经节中TrkA及TrkA mRNA的表达：在正常背根神经节中，可见大量的神经元表达Tr—kA，染色较深，免疫组织化学切片分析结果显示阳性细胞的平均吸光度为13．100±3．408。原位杂交组织化学染色亦显示背根神经节中有Trl mRNA阳性表达细胞。
2．神经损伤、再生及应用外源性NGF注射后背根神经节中TrkA及TrkA mRNA的表达：神经损伤后，背根神经节中Trl 阳性表达神经元明显减少，其染色的深度也明显变浅，以手术后7 d降低最为明显，随神经的再生，背根神经节中TrkA阳性表达细胞逐渐增加。应用NGF靶肌肉注射后，背根神经节中Trl表达阳性神经元的数量明显增多，手术后28 d，应用NGF注射组动物的背根神经节中Trl 阳性表达细胞的数量及表达浓度与正常表达相同。术后7 d，对照组动物的背根神经节中TrkA mRNA阳性神经元较正常明显减少，而实验组动物背根神经节中TrkA mR．NA阳性表达神经元的数量较对照组明显增多。
3．图像分析结果(表1)：神经损伤后，TrkA的表达明显降低，随神经的再生，对照组神经元TrkA阳性表达呈逐渐恢复的趋势，而实验组与对照组比较，其A 值明显增加。
讨 论
1．正常神经节中TrkA及其mRNA表达的意义：NGF通过与其效应细胞膜上的特异性受体结合来介导其生物学作用。NGF的效应细胞膜上存在两种不同性质的受体，即高亲合性与低亲合性受体。低亲合性受体是一种分子量为75×10 的酸性糖蛋白，对NGF无特异性，但对TrkA 的激活具有调节作用。高亲合性受体能与NGF特异性结合，是NGF的功能性受体。高亲合性神经生长因子受体与TrkA原癌基因的产物有关。Trl 是1种分子量为140×10 的糖蛋白，与NGF结合后，能迅速磷酸化，诱导效应细胞的有丝分裂变化。TrkA在背根神经节中的分布，文献报道不完全一致 J。在胚胎期，NGF具有促进外周交感与感觉神经系统的发育、存活的作用，TrkA及低亲合性神经生长因子受体均高效表达。而成年动物背根神经节中表达TrkA的神经元明显减少。
本实验发现，在成年大鼠的背根神经节中，存在TrkA阳性表达细胞。成年动物背根神经节中仍存在TrkA的表达，表明NGF在成年动物体内仍具有一定的作用，最近研究表明，激活神经营养因子受体能引起神经营养因子的释放，而释放的神经营养因子又能通过激活Trl而激活神经生长因子的自合成分泌循环，导致神经生长因子的合成与分泌增加，维持神经功能。TrkA的存在是否与介导神经营养因子的此种功能有关，有待于进一步研究。
2．周围神经损伤、再生及外源性NGF对Trl 及其mRNA表达的影响。神经损伤引起的TrkA表达的变化可能与神经损伤的部位有关。中枢神经元轴突的损伤能引起基脑神经元TrkA表达的上调。而周围神经损伤后，背根神经节中TrkA的表达明显下降，随周围神经的再生，Trl 的表达逐渐恢复[6-8]。这种表达的调节与内源性神经生长因子的作用有关，神经损伤早期，轴突与靶器官的联系中断，靶组织产生的NGF不能逆行运输到神经元，故TrkA 的表达下调，后期，神经再生，重新支配靶器官后，TrkA的表达恢复正常。外源性神经生长因子对TrkA 的表达也有重要的调节作用，在应用NGF抗血清处理实验动物后，p75NGFR及TrkA的表达均降低。灌注NGF后，其效应神经元TrkA表达明显增加[9,10]。本实验结果与上述发现相同，靶肌肉注射NGF后，背根神经节中Trl表达阳性的神经元数量明显增加，手术后28 d，与正常背根神经节中TrkA表达的量差异无统计学意义(P>0．05)。手术后7 d，应用外源性NGF靶肌肉注射后，动物背根神经节中神经元TrkA mRNA的表达较对照组亦有明显改变，其阳性细胞数及表达量均增多。结果显示靶肌肉注射NGF能增加神经损伤后背根神经节中神经元TrkA的表达，表明靶组织注射外源性NGF能诱导神经生长因子效应细胞内功能性受体的产生，增强神经生长因子的生物学作用，从另一侧面证实通过靶肌肉注射NGF能促进周围神经再生，保护神经元，为临床的这一用药途径提供了进一步的理论依据。
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