中国神经免疫学和神经病学杂志2004年7月第11卷第3期Chin J Neuroimmunol＆Neurol 2004，Vo1．11，No．3
姚晓黎，张成，刘卫彬，卢锡林，张为西，叶俊鹏
(中山大学附属第一医院1．神经科，2．药学部，广东广州510080)
基金细项目：卫生部临床学科重点项目(2001321)，美国ALS基金；211 工程项目
作者筒介：
姚晓黎(1971一)，女，福建省人，讲师，在读博士。
张成 (1957一)，男，四川省人，教授，博士生导师，主要从事遗传和神经变性疾病研究．
摘要 目的：初步探讨利鲁唑对肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者血浆谷氨酸的改变，为临床治疗提供依据。方法：应用毛细管电泳一激光诱导荧光检测器，测定ALS患者和对照组血浆及脑脊液(CSF)谷氨酸水平，以及部分ALS患者服用利鲁唑后血浆谷氨酸水平，并进行统计分析。结果：ALS患者血浆、CSF谷氨酸水平分别为(75．65±20．44)和(8．11±2．71)／~mol／L，与对照组相比差异有显著性(P<0．05)。ALS患者服用利鲁唑后，血浆谷氨酸的水平为(66．19±10．27)／~mol／L，与服药前比较差异有显著性(P<0．O5)，但仍高于对照组。结论： ALS患者血浆和CSF谷氨酸水平较正常为高。ALS患者在口服利鲁唑后血浆谷氨酸水平有所下降，但仍高于正常水平。
中圈分类号：R744．8 文献标识码：A 文章编号：1006—2963(2004)03—0139-03
Key words：amyotrophic lateral sclerosis；glutamate；riluzole
肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral selerosis，ALS)是一种选择性侵犯运动神经元的致命性、进行性神经系统变性疾病，多于40---50岁起病，男性患者多见，一般于发病后3～5年死亡。发病机制尚未完全清楚，谷氨酸兴奋毒性引起神经元变性是其主要机制之一。利鲁唑(2一氨基一6一三氟甲氧基苯并噻唑)是一种谷氨酸拮抗剂，目前被认为是惟一可延长ALS患者生命的药物。该药在国内应用时间短，目前尚未见有关临床研究报道。作者应用毛细管电泳一激光诱导荧光检测器(capillary electr0ph0resis with laser induced fluorescein，
CE—LIF)测定ALS患者和对照组血浆及脑脊掖(CSF)谷氨酸水平，以及部分ALS患者服用利鲁
唑后血浆谷氨酸水平，旨在了解ALS患者血浆、CSF谷氨酸的变化，以及利鲁唑对谷氨酸浓度的影响。
1 资料和方法
I．I 研究对象
1．1．1 病例组：收集2000一O1—20O2—01 ALS患者45例(女l1例、男34例)，年龄18～79岁，平均(44．44±13．38)岁。所有患者按世界神经病学联盟制定的ALS诊断标准Eli确诊，其中31例患者行腰穿做CSF检查，另14例患者拒绝行CSF检查。对23例ALS患者进行了利鲁唑疗效观察研究。
1．1．2 对照组：为同期行腰麻手术的非神经系统变性病患者46例(男31例、女15例)，年龄17～76岁，平均(41．24±12．50)岁。两组间性别和年龄差异无显著性。
1．2 试剂与仪器
1．2．1 毛细管电泳仪：购自美国Beckman公司。CE—LIF最常用的激发光源是氩离子激光器的488nmol／L谱线。衍生化试剂：异硫氰酸荧光素异构体I(fluorescein isothiocyanate isomer I，FITCI)购自Sigma公司。谷氨酸标准品购自Sigma公司。
1．2．2 毛细管电泳的分离条件设定：(1)开口石英毛细管总长度380 mm，有效长度300 mm，内径75／2m；(2)电压28 kV，温度2O。C；(3)压力进样8S；(4)每次进样之前，毛细管均要经HC1(O．1 mol／L)，NaOH(O．1 mol／L)、三蒸水、四硼酸钠缓冲液(O．03 mol／L，pH9．8)冲洗，冲洗时间各2 min。
1．3 方法
1．3．1 标本收集：病例组和对照组均抽取空腹外周静脉血3 mL，取血浆，保存于一8O。C冰箱备用。常规腰穿留取2 mL CSF，保存于一8O。C冰箱。其中23例ALS患者口服利鲁唑(50 mg，2次／d)3个月后，取血浆标本。1．3．2 衍生化反应过l星：取1．5 mL EP管，加入100L谷氨酸标准溶液或待测标本、400 L NaHCO。液(2O mmol／L，pH9．6)、10 L FITC一丙酮溶液(6×10一mol／L)，混匀；室温、黑暗中反应16 h。1．3．3 建立谷氨酸标准曲线：取2×10～、5×10一、l×10～、3×10～、5×10～、7×1O～、1×10 mol／L谷氨酸标准溶液各100 L，进行衍生化反应。在毛细管电泳仪上进行分离，测定相应的荧光强度(relative fluoresces units，RFU)。以谷氨酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
1．3．4 血浆和CSF标本的检测：所有血浆标本稀释100倍，CSF标本稀释1O倍。标本经去蛋白、衍生化反应后，应用CE—LIF测定谷氨酸浓度。
1．4 统计学处理 计量资料以 ±s表示，组间差别采用t检验和方差分析进行判断。全部数据均输入SPSSIO．0统计软件包进行统计分析。
2 结果
2．1 谷氨酸标准曲线： 谷氨酸标准溶液与荧光强度的线性相关系数r=0．997，直线回归方程j，一47．O12 一4．816。
2．2 ALS患者血浆和CSF谷氨酸水平检测ALS组血浆和CSF谷氨酸浓度[(75．65±2o．44)、(8．11±2．71)t2mol／L]与各自对照组[(57．96±3．40)、(3．81±0．86)t2mol／L]比较差异有显著性(P < O．001)。
2．3 服用利鲁唑前后ALS患者血浆谷氨酸水平检测 23例ALS患者服用利鲁唑后血浆谷氨酸水平[(66．19~10．27)t2mol／L]与服药前[(81．27±21．63)t2mol／L]比较差异有显著性(P<o．001)，但仍高于对照组(P<O．001)。
2．4 服用利鲁唑前后ALS患者临床症状变化 1例45岁男性患者以言语不清和吞咽困难为首发症状，半年后出现肢体无力。服药3个月后，肢体无力加重，但吞咽症状有所改善，如吞咽有力和饮水呛咳减轻。1例25岁男性患者以双上肢无力1年就诊。服药3个月后，自觉双手活动较前灵活。其余患者临床症状无明显改变。
3 讨论
ALS患者血浆、CSF谷氨酸浓度是否升高一直存在争议。Perry等嘲研究认为ALS患者血浆、
CSF谷氨酸浓度并无升高。Shaw等嘲则认为ALS患者血浆谷氨酸水平不变而CSF谷氨酸浓度升
高。Camu等 ]发现ALS患者CSF谷氨酸浓度未升高，血浆谷氨酸水平与首次发病部位有关，肢体首发型血浆谷氨酸水平升高，而延髓首发型血浆谷氨酸水平降低。Rothstein等，Niebro等，以及Royberg等报道ALS患者血浆、CSF谷氨酸浓度均升高，这与该研究结果相符。
体外培养发现谷氨酸浓度大于1 0／~rnol／L时对神经元有毒性作用。CSF谷氨酸浓度大于10／~rnol／L可能影响脊髓细胞外液，使细胞外液谷氨酸浓度升高。谷氨酸从突触间隙扩散出来被转运到血液中去，结果引起血中谷氨酸水平增高，导致兴奋毒性和神经元变性。该研究也发现CSF谷氨酸比血浆谷氨酸稳定，对ALS患者而言，检测CSF谷氨酸浓度更有意义。
利鲁唑是一种抗谷氨酸药物，通过多种途径对抗谷氨酸的兴奋毒性。该组有23名患者服用利鲁唑50 nag，2次／d，共服药3个月后检测血浆谷氨酸浓度，结果发现服药后血浆谷氨酸水平有所下降，但未能降至正常水平，可能与服药时间较短(3个月)有关。其中1例曾出现上腹部不适，后改为饭后服药则症状消失。由于利鲁唑价格昂贵，许多患者未能继续服药完成疗程。该研究结果与Couratier等[9] 的实验研究报道一致。在大鼠皮质神经元培养原液中加入ALS患者CSF所产生的兴奋毒性作用，可被利鲁唑减轻。ALS患者CSF的5O 稀释液可引起神经元死亡，神经元存活率仅为45 (对照组用健康者CSF同样处理，神经元存活率约88%，而加入0．5／~rnol／L利鲁唑后神经元存活率约为61%.也有报道停止服用利鲁唑后ALS患者血浆、CSF谷氨酸水平又会升高。作者未曾观察到这种现象。ALS患者血浆、CSF谷氨酸浓度升高间接证明了谷氨酸兴奋毒性作用，为ALS治疗提供了参考依据。
此研究证实抗谷氨酸药物利鲁唑可降低ALS患者的谷氨酸浓度。Dunlop等En]也发现利鲁唑可提高脊髓突触摄取谷氨酸的能力。此能力在转基因ALS鼠的疾病早期明显存在，而在晚期则消失。因此，早期诊断、早期治疗对控制ALS病情进展、延长ALS患者生命会有一定帮助。同时，检测ALS患者血浆、CSF谷氨酸浓度对ALS患者应用利鲁唑治疗也会有更好的指导作用。
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