肌萎缩侧索硬化患者血浆和脑脊液谷氨酸改变及利鲁唑对血浆谷氨酸的影响
中国临床神经科学2OO4年第12卷第3期
樊汉青，蒋雨平 ，朱秋毓
(复旦大学附属华山医院神经科，肾病实验室200040)
关键词:肌萎缩侧索硬化； 谷氨酸； 高效液相色谱法
[文章编号] 1008-0678(2004)03-0236-03 [中图分类号] R744．8 [文献标识码] A
[基金项目] 上海市科学技术发展基金(oo4119005)和安万特公司资助．一申请人。
[作者简介] 樊汉青．女(1971一)，上海市人，硕士，复旦大学附属华山医院，主治医师，主要从事运动神经元病的研究。
摘要 目的：了解肌萎缩侧索硬化(ALS)患者血浆和脑脊液谷氨酸浓度改变，以及药物干预对谷氨酸水平的影响。方法：应用HPLC方法对A工s患者进行血浆和脑脊液谷氨酸测定。结果：① 患者血浆中存在兴奋性谷氨酸显著增高，谷氨酸浓度与性别、年龄、病程均无关。②力鲁唑(力如太)治疗1个月后，血浆谷氨酸浓度下降，而环磷酰胺治疗变化不明显。③ 脑脊液中谷氨酸浓度未见明显变化。结论：ALS患者存在谷氨酸代谢异常，但谷氨酸可能不是ALS致病的惟一途径。
A Study Oil Levels of Plasma and CSF Glutamate in ALS Patients and the Efect of Riluzole Treatment on Plasma
Glutamate FANHart—Q ng，JIANG t~Ping，ZHUQiu-Yu．Department ofNeurology，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200040，
China
KEY WORDS amyotrophic lateral sclerosis(ALS)； glutamate； high performance
肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种病因仍不明确的中枢神经系统上、下运动神经元选择性受累的缓慢进行性的变性病，其发病机制有多种假说，其中更以谷氨酸兴奋毒性假说突出。本研究通过测定ALS患者血浆和脑脊液的谷氨酸水平，了解谷氨酸在ALS患者是否存在异常增高，并且通过对患者的随访，了解作用于兴奋性氨基酸途径的ALS治疗药利鲁唑干预是否会对血浆谷氨酸水平产生影响。
资料和方法
研究对象选取1999年一2002年在我院门诊及住院的ALS病例34例，所有病例均符合World Federation of Neurology(wry)El Eseorial诊断标准，即将3个区域同时有上、下运动神经元损害证据或2个区域有上、下运动神经元损害证据，病情进行性进展伴有上运动神经元体征向下发展的病例作为人选对象。男25例，女9例。平均年龄(50．6±9．6)岁。平均病程(16．5 4-13．4)个月。所有ALS病例均为散发。其中28例患者进行了血浆谷氨酸浓度的测定，28例患者进行了脑脊液谷氨酸浓度的测定。对照组共7人(男5名，女2名)，平均年龄(53．7±12．6)岁。为正常人或紧张型头痛患者。两组年龄经t检验，无差异；两组性别构成比经精确四格表检验，无差异。谷氨酸浓度测定谷氨酸标准液配制：谷氨酸147 rag，加0．1 mol·LI1盐酸至50 mL制成谷氨酸储备液。分装，一20℃冷藏待用。工作液用0．01 mol·LI1盐酸稀释至所需浓度。一4℃冷藏待用。邻苯二甲醛
衍生化试剂配制：邻苯二甲醛22 mg，依次加人500止无水乙醇、9 mL 0．1 mol·L-1硼酸缓冲液(pH 10．4)、500亚硫酸钠(1 mol·L-1)，摇匀，4~C冷藏待用。色谱条件不锈钠材质色谱柱，填料为：LiChrosorb C18，250 InlTl×4．6 InlTl，粒度5 uo流动相A
为0．1 mol·L 醋酸缓冲液，用醋酸调至pH 6．4。流动相B为纯甲醇。用前均经0．45 u膜过滤。无需脱气。柱温设定为40℃，紫外检测器用于检测谷氨酸．邻苯二甲醛衍生物，检测波长设定为338 nlTl。氨基酸分离采用梯度洗脱法进行(见表1)。所用仪器为1100系列HPLC色谱仪(Agilent公司)。
结 果
AlAS组和对照组血浆谷氨酸浓度与对照组比，28例ALS患者血浆谷氨酸值明显升高(P<0．05)。按起病部位的不同再将利鲁唑组分为两个亚组，首先出现吞咽和构音障碍、舌肌萎缩等症状的患者为延髓组，首先出现单侧或双侧上肢无力，肌萎缩等损害的患者为肢无力组，重新比较结果发现亚组问无差异(表2)。
药物干预对血浆谷氨酸浓度的影响 17例ALS患者随访了血浆谷氨酸浓度，其中1O例经利鲁唑治疗，7例经免疫治疗，结果显示利鲁唑组治疗前后血浆谷氨酸浓度呈显著性下降；而免疫治疗组尽管能看到血浆谷氨酸浓度均值下降，但是其差异未达到统计学意义(表3)。
表3 不同治疗组对血浆谷氨酸浓度的影响(浓度单位为limol·LI1)利鲁唑组治疗前后血浆谷氨酸浓度下降，P<O．05
讨 论
Lucas报道鼠的视网膜在全身注射谷氨酸后，出现兴奋性毒性反应。谷氨酸是中枢神经系统的一个最主要的神经递质，谷氨酸聚积在神经突触，当达到毒性浓度时可造成神经元的死亡，谷氨酸兴奋毒性学说也是ALS三大发病机制之一。
Plaitakis等人认为在ALS患者中存在谷氨酸代谢异常，其依据是发现ALS患者血浆中谷氨酸水平增高，口服谷氨酸后，患者血浆谷氨酸浓度仍要比正常人高，推测造成这些变化的原因是由于氨基酸转运和降解异常。此后又有一些研究支持这一观点，Rothstein_5 J等利用反相高效液相测量了l5例ALS患者脑脊液中谷氨酸浓度为(O．80±0．31)tmaol·L～，较对照组明显增高。然而也有不少学者持否定意见，Perry 认为谷氨酸的增高可能和技术因素及有无禁食有关。对标本处理方法的不同被认为是导致这些相互矛盾结果的原因。在本组研究中，我们采取空腹状态下留取标本，避免了外源性食物因素的干扰。标本的制备参照Perry[6]的方法。结果发现ALS患者空腹血浆谷氨酸浓度均值要明显高于对照组，支持散发型ALS中的确存在谷氨酸代谢异常。本研究同时发现，患者脑脊液谷氨酸浓度和对照组没有差异，这个结果和一些报道[3,7,8]相背，但和Perry[ ]报道一致。Shaw报道ALS患者只有30％出现脑脊液谷氨酸的升高，其余均在正常范围内。研究[9,10J发现在ALS患者中枢神经系统一些区域谷氨酸有显著的下降，认为ALS患者可能存在谷氨酸代谢、转运和贮存的缺陷。结合我们的研究结果，认为ALS的发病可能是多因素的结果，兴奋性氨基酸参与了ALS的发病，但中枢神经系统谷氨酸水平可能不是致病的直接原因，推测谷氨酸可能是一个促发因素，外周循环的谷氨酸浓度异常增高引起一系列反应致神经元的损伤。而且年龄、病程、性别不是影响谷氨酸浓度的因素。在所有调节谷氨酸兴奋递质系统的药物中，利鲁唑(氨基一2一三硫甲氧一6一苯并噻唑)是最突出的一个药物。
国外通过两次大规模多中心临床试验，证实该药物可延缓ALS患者机械通气时间，从而延长患者生存时间，提高生活质量。然而，迄今为止，其确切的作用部位还不清楚，它可能在中枢神经系统突触前抑制谷氨酸的释放；也可能通过阻断电压依赖性的钠通道、影响G蛋白信号传递、减少NMDA(|7v．甲基一D一天冬氨酸)受体的过度兴奋、减少钙内流而发挥突触后的作用。本研究显示，l0例接受利鲁唑治疗的患者，血浆谷氨酸水平有显著下降，而在免疫治疗组，谷氨酸浓度变化不显著。研究再次证实尽管利鲁唑作用环节不明，它确实作用于谷氨酸代谢途径，对体内谷氨酸代谢产生影响。本研究证实ALS患者血浆中确实存在兴奋性谷氨酸增高，认为谷氨酸参与了ALS的致病。利鲁唑治疗后血浆谷氨酸浓度下降，也证实了该药物作用于谷氨酸代谢途径。由于脑脊液中谷氨酸浓度与对照组比，无显著差异，故认为中枢神经系统谷氨酸水平可能不是致病的直接原因。
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