自然杂志19卷4期 科技进展
王泽洪 高汝龙 (中山医科大学中山眼科中心)
王泽洪博士，中山医科大学中山眼科中心 主治医师，广州510060
神经生长因子是近10年神经生物学研究的主要内容和热点之一．本文概述了从神经生物学的各个方面如神经胚胎发育学、神经生理、神经化学、神经免疫、神经病理和神经药理对神经生长因子的研究进展，并阐述了视觉神经生物学如视神经的再生等与神经生长因子的关系，讨论了其在临床医学中的应用状况和眼科学中的应用前景．
Bucker(1948) 首先报道将小鼠肉瘤S一37，S180接种于三天鸡胚的绒毛膜尿囊内，发现其旁周的脊神经节长出的感觉神经纤维进入肿瘤组织内，同时该脊神经由于感觉神经元数目和体积增大而增大，约大于对侧脊神经节的33 ，感觉和交感链增大了2O．随后Levi—Montalcini(1953) ，发现感觉神经系统和脊神经节一样，有许多密集的神经纤维长到肿瘤移植物中去．感觉神经节的体积增大了l倍，交感神经节增大了5倍．当时她猜想肿瘤内有某些生长因子吸引发育中的神经生长，随即通过组织培养法，把肿瘤小块组织与鸡胚的神经组织(脊神经节及感觉神经节)放在一起培养，两者之间相隔几个毫米，观察到神经细胞朝着肿瘤的一面生长出大量的神经纤维像星芒状环绕着肿瘤小块．证实了以上猜想．通过她和其他许多科学家的努力，一种促进神经生长的因子——神经生长因子(nerve growth factor，NGF)终于分离出来了(Cohn 19560 ).
NGF为神经系统最为重要的生物活性分子之一，是近40年来了解最清楚的一种神经营养因子．由于Levi—Montalcini和Cohn在神经生长因子方面的杰出工作，她们荣获了1986年诺贝尔生理医学奖．基于她们的研究，人们对许多疾病产生了新的认识，包括发育异常，老年性痴呆症中退行变性，伤口愈合和肿瘤，视神经损伤和再生等．我国对NGF的研究和f临床应用是近来才起步的，在I临床神经疾病的应用上，只在某内部刊物上见到两篇少量病捌报道，无视神经疾病包括外伤及眼底疾患的临床应用报道．以下着重介绍NGF在眼科学中的应用前景．
一、NGF的来源
NGF存在于动物体内，主要来源为唾禳腺、前列腺、蛇毒及脑内胆碱能神经元支配区，其中以成年雄性小鼠颌下腺最高．其次为啄鼠前列腺和蝰蛇、腹蛇及眼镜蛇的毒腺．NGF还存在于小鼠唾液腺(Cohn 1960) ，肾上腺髓质嗜铬细胞及肉瘤S一180，S-37(Goldstein，1978 )中，另外还存在于鸡胚胆碱能神经元及人黑色素瘤等组织中 ．除以上外，在动物体，含有NGF活性的正常细胞还有成纤维细胞、虹膜平滑肌、骨骼肌、胶质细胞和神经鞘细胞(Chapman 1979 ，Johnson 1972 ，Murply 1 977 ) Chakrabarti(1990) 用免疫学方法证实在BB 鼠视网膜节细胞 Muller细胞、色素上皮细胞和近内界膜的区域含NGF．Korsching (1986) 报道在成年大白鼠中枢神经系统每克组织NGF含量为海马1．41± 0．O8 g，视神经和视顶盖O．07± O．0l ng．Hayashi(1 990) 在成年弥猴枕叶皮层NGF的含量为361．7士1 30．8 Pg／g皮层组织。
二、NGF结构与受体
1． 结构
小鼠颌下腺NGF是7sNGF的高分子物，此分子中含有α、β、γ三个亚单位分子和Zn．其分子量为l4万，其生物学活性的βNGF 为一种二聚体和三个二硫键共价结合起来的两条完全相同的链，共为一种已知氨基酸顺序的蛋白质，分子量为2．2×10（-28）kg，由118氨基酸和1068个碱基对组成．McDonald (1990) 用x 光晶体衍射技术发现NGF的活性部位βNGF是由六方双锥体形晶体对称结构组成，7s由α2β2γ2组成．Ullich(1983)用小鼠NGF cDNA 为探针从人DNA 文库中克隆出人类NGF基因，并从碱基排列推导出人的NGF氨基酸排列有90%与小鼠相同，NGFβ亚基第一位氨基酸和118位精氨酸羧端发生裂开后才有活性，即βNGF转变为活性型βNGF。
2．受体
NGF的作用需要在靶细胞表面有一个特异的受体，即NGF的作用取决于一定数量的受体存在．NGF分子必须进入神经细胞内才能发挥其分子生物学功能，轴突膜上有能识别并结合NGF分子的特异受体．有人观察到NGF受体只存在于胚胎神经，而成年神经上无，说明产生NGF是幼稚细胞的一个特性．这和动物发育期需要NGF的观点是一致的．NGF靶细胞上有三种结合部位：膜结合部位、核结合部位与轴突结合的部位．Turner(1979)证实在哺乳动物脑胆碱能神经元和蜂蟪视神经纤维中有特异的NGF受体，NGF分子捧列与膜的糖蛋白有关，βNGF可
能为活的纤维母细胞中膜蛋白的一种复合物，膜糖蛋白与NGF分子形成一种超分子复合物，这种糖蛋白可能就是NGF受体．用免疫荧光技术证实NGF分布与成纤维细胞ConA 结合物相当．现已知人和鼠的NGF受体蛋白质的氨基酸顺序．在视系统的上丘、外膝体、顶盖前区和视交叉上核内的视网膜神经节细胞轴突终末的NGF受体与注入INGF结合，可在视阿膜神经节细胞胞体测得 I，但这种逆行转运是特异的．Chakrabarti(1990) 用单克隆抗体(MC192)证实在BB鼠视网膜色素上皮细胞和Muller细胞存在NGF受体，而视阿膜节细胞无．
三、NGF的作用机制
NGF可通过与细胞表面的NGF受体结合，经内在化(internationalization)转运至核周体，进而与核周体结合，引起一系列效应．这表现在：(1)NGF可使胞内内源性的cAMP水平升高．(2)可以激活丝氨酸蛋白激酶成为蛋白激酶，可以引起PC-12细胞的胞浆及核内蛋白质丝氨酸、苏氨酸基碑酸化 (3)NGF可诱导PC一12细胞中擞丝蛋白mRNA的表达，使檄管相关蛋白(MAP)及微管蛋白水平增高，磷酸化形式增多．(4)NGF引起的胞内某些代谢指标的变化+如多胺、糖脂、核苷醴及氨基酸的变化，它还可使神经粘连分子(N-CAM)表达 NGF的作用依麓于膜结合与核结合，NGF与其受体结合后，使其柯型发生变化，然后这一信息逆向神经胞体传导．对神经元发生营养作用．
1．促进胚胎神经发育及维持成年交感神经和感觉神经元的存活
Cohen(1956) 、Nja(1979) 切断幼年小鼠交感神经节后纤维或用药物破坏其末梢，节细胞的胞质发生溶解，而用NGF处理纤维近侧端，则交感神经末梢吸收NGF后经逆行运输至神经细胞体，可以防止节细胞染色质溶解而引起的死亡，并证实其有维持交感神经节细胞存活的作用．Johnson(1986)用抗NGF的抗体免疫田鼠，胚胎期的仔鼠缺乏感觉神经元，造成感觉神经免疫切除 状态，说明感觉神经发育不能缺少NGF．NGF不仅对维持周围神经元的生存和神经突的生长有极其显著的促进作用，而且有促进细胞增大、神经元增殖的作用．Cohea(1956)用小鼠抗NGF血清处理神经节细胞，然后进行组织培养，或去除培养液中NGF后，都会使神经细胞急速死亡，说明无论在体内还是在体外，神经元的存活和生长都离不开NGF，它对于生命某些阶段的某些神经元群的生存是必需的，虽然交感神经元在动物的一生中都对NGF起反应+但其在胚胎和初期敏感性最高，NGF同时对成年交感神经元的正常功能起到维持作用，有人报道脑神经元存活也离不开NGF．
2．促进周围神经系统的生长和分化，决定轴突生长的方向
Cohen(1960)从颌下腺提纯出NGF，用NGF抗体破坏周围交感神经元来证实NGF的生理功能．NGF抗体注入新生小鼠和大鼠后可以阻止交感神经元的发育．说明NGF对交感神经元和某些感觉神经元个体发育是必需的，它可以促进神经r矸维的生长，加快轴突转运；如将含类似NGF 的视网膜神经节细胞诱向园子(RGNTF)凝胶条与视网膜组织条块共同培养时，前者诱导视阿膜神经节细胞轴突向RGNTF生长，Theoeren(1971)证实在交感神经节NGF促进胰蛋白羟化酶 多巴胺羟化合成，加强轴突快速转运，其控制交感神经节某些胚胎的感觉神经元的发育和分化．决定轴突生长的方向、Greene(1980) 取胚胎期的鸡胚脊髓感觉神经元的椎周、椎前交感神经节，用胰蛋白酶分离细胞后，再加上NGF进行培养，一日内可见神经元发生有丝分裂、细胞增大．神经纤维延长，同时细胞内发生各种变化，核仁，内质网及高尔基体变大．鸟氨酸脱羧酶诱导增加+致RNA和蛋白质合成增加，微丝、微管等管状细胞器增多，肌动蛋白及葡萄糖利用加快，神经细胞内的氨酸羟化酶(TH)和胆碱乙酰化酶(CAT)等递质合成酶及多巴胺 羟化酶(DBH)活性增高，细胞中CAMP合成增多．
3．对中枢神经系统的影响
NGF在中抠神经系统有以下几个方面的作用：(1)使培养的腱碱能神经元CHAT、ACHE活性增加．(2)新生鼠脑室注射NGF后，酶活性增加．(3)在实验性胆碱能神经元损害中的作用为保护胆碱能神经元升高CHAT、ACHE活性．促进佣支发芽．在脑区注入NGF+交感神经节细胞突起，经被根节长入脊髓，继续向注入NGF的脑区生长．NGF不仅对脑细胞有作用，而且对正常脑的发育及其机能维持中枢神经元的生存非常重要，至少中抠神经系统的基底前和纹状体胆碱能神经元的发育，分化需要NGF．
五、眼科学研究及应用展望
1．眼源性NGF及视觉系统NGF受体
(1)眼源性NGF
Turner(1980) 将一片组织植入前房内，移植组织原来的神经纤维组织变性，而受到虹膜神经纤维的再支配，这种神圣支配是在NGF驱使下进行的．在鼠单眼前房内注入INGF，放射性物质聚集在注射侧的颈上神经节(superior cervical garglion，SCG)90 INGF通过虹膜神经末梢沿轴突逆行运输至SCG，只有少量神经元被标记(说明这些神经元支配虹膜)．自显影电镜和细胞组化研究表明，在神经末梢和轴突NGF存于小泡，未发现细胞核和细胞质中有游离的NGF．Ebendal(1980) 用鼠外植虹膜与几种神经节共同培养发现虹膜能合成和分泌NGF，激发交感及感觉神经节的神经元长出突轴并介伸入虹膜，当虹膜移植物上有神经长入后．NGF消失．这种支配可调节存在于组织内NGF的水平，强有力地说明虹膜的失神经支配可导致虹膜内出现，NGF神经末梢通过调节其产物或通过逆行运输来影响NGF的含量．另外，用NGF抗体可几乎完全抑制神经轴突的生长，但与受彖害的虹膜细胞共同培养中，未发现NGF的活性，却可以明显地促进睫状神经节神经元轴突长出．另外，用抗NGF抗体不能抑制这种作用，表明虹膜除能产生NGF外，还能产生一种副交感NGF Korsching(1986)。还发现在成年太白鼠视神经和顶盖中，每克组织NGF含量为0．07士0．01 ng·只为海马的1／20，以上说明在动物虹膜，视神经中存在内源性NGF．Hayashi(1990) 证实在弥猴视皮层也含有NGF，含量为5～10 Pg／g脑组织．
(2)视觉系统NGF受体
Lund(1986)证实在视网膜节细胞MSller细胞有NGF受体．fan(1988) 对在个体发育中的大鼠视网膜、视神经和视束的检测都发现存在有NGF受体．另外，在视系统的上丘、外侧膝状体、顶盖前区和视交叉上孩内的视网膜节细胞轴突终末存在NGF受体，它能与NGF结合进行逆行性转运．Carmingnoto(1990)0 也在视网膜节细胞、外膝体、视皮层发现低亲和性NGF受体的编码．他(1991) 又采用INGF交联和免疫沉淀法证实鼠视网膜节细胞可表达Pt 和Ph，而两者都包含在NGF受体中．Merighi(1992)0 采用原位核酸杂交法证实了人类视网膜节细胞也存在Pt，而Ph被普遍认为具有调节NGF的生物效应的作用，因此人视网膜节细胞也可表达NGF的高亲和受体，对NGF的作用敏感．
2．NGF与视神经再生
(1)视神经再生
视神经的再生+实际上指视网膜节细胞轴突的再生．这在低等脊锥动物如蝾螈、金鱼容易发生．而在哺乳动物的视神经损伤后，不能再生．近1O年来在啮齿动物如小鼠损伤视神经，采用植入法或桥架自体外周神经端等方法证实哺乳动物包括成体视神经具有再生能力．
(2)NGF与视神经再生
Carmlngnoto(1989) 认为NGF对视觉系统有作用，在视阿膜水平上，NGF可以促进成年小白鼠视神经切断后视网膜节细胞的存活．Turner(1988) 认为通过应用NGF刺激视网膜节细胞再生是恢复视功能的方法之一，在小白鼠视神经损伤后发现该损伤区有促进轴突再生的NGF等生物大分子，电镜也观察到神经节细胞的再生轴突．尤其是在靶组织内形成有功能的突触样结构．Turner(1979) 切断蝾螈视神经轴突，眼内注射200个生物单位NGF，光镜证实NGF可以促进视网膜节细胞的反应．光镜下在对照组视神经切断后14天视网膜节细胞核反应即染色质的变化百分比最高+而应用NGF后视网膜节细胞在轴突切断1～7天后就进入核反应期，7天时染色质变化就已达到高峰，比对照组明显早，而且核反应持续时间要长1周．电镜下也证实核周
质细胞器如线粒体的变化也要早1周，而且核仁数目要增多两倍，高尔基体密度增加，认为在NGF蝾螈视神经轴突切断后可刺激视神经再生和视阿膜节细胞对轴突切断后的反应，其机制主要是刺激其依赖DNA的RNA合成．蝾螈视系统可以作为NGF调节的中枢神经再生反应的理想模型．
Turner以后一系列实验证明NGF及起其抗血清对蝾螈、金鱼的视神经再生有影响．Turner(1980) 认为金鱼和蝾螈一洋，都可作为良好的视神经再生模型，在切断视神经后，眼内注射NGF 1周后，视阿膜节细胞胞体．棱仁明显增大，50%的棱细胞进入核分裂期 两周后核活动明显，DNA、RNA 台成增多，高尔体、线粒体也增多，核及棱周体增大，说明NGF可以加速切断了的视神经的修复和再生．Turner(1979)⋯在蝾螈视神经轴突切断后玻璃体内注射NGF抗血清，7天后可见祁阿膜节细胞核仁隆起减少45%，核仁面积减少49%，核染色质减少33%．Turner(1981) 在体外应用NGF抗血清能阻止金鱼视网膜节细胞轴突向外生长．球内注射和玻璃体内注射NGF抗血清，视阿膜节细胞明显减少，7天后核仁缩小45%．视神经轴突再生指数(neurite growth index．NGI)下降至7O%．用纯抗血清核仁可缩小至58%．金鱼的枧神经再生和对NGF反应比蝾螈还强烈．在有尾两栖动物用抗NGF血清并不能完全阻止视神经再生．在新生猫、鼠中可阻止97%～99%的视神经再生，这反过来证明NGF在视神经损伤后修复和再生的重要作用．Henry(1982)给予金鱼眼内注射外源性NGF，可缩短金鱼视神经恢复对光的紧张性反应时间的2O%～24%．推测在人视神经再生中可能有NGF样分子起作用．MMfei(1990) 指出．在视阿膜神经节细胞轴突切断损伤后．可以通过提供NGF或FGF(fibroblast growth factor)使视网膜节细胞可免于死亡．Thanos(1991)发现，在眶内段切断小鼠视神经后，神经节细胞发生逆行性变性．小胶质细胞吞噬神经节细胞，如给予NGF和
bFGF(basic fibroblast growth factor)及BDNF(brain．derived neurotrophic factor)可阻止神经节细胞坏死，促进视神经轴突荐生．虽然NGF比bFGF免于神经节细胞死亡数目步，但也说明了NGF对视神经再生的作用．
3．眼科临床应用前景
目前视觉系统的一些疾病如视网膜色素变性、视神经炎、眼挫伤、青光眼等所引起的视神经萎缩以及缺血性枧神经病变、黄班洞、视网膜脱离术后枧功能差者等仍无较好的治疗方法由于NGF的系列实验表明对视网膜节细胞存活、视神经纤维再生有作用，NGF眼部的给药途径有局部滴用、结膜下注射、前房及玻璃体内注射等方法．作者认为NGF可以作为神经生物制剂对
以上眼病的治疗进行探讨．
(1)缺血性眼病
Siliprandi(1 991) 在猫和鼠的实验中采用升高眼压至14．7～16 kPa然后降至正常导致视网膜缺血的摸型，观察NGF对其缺血的视网膜有无神经节细胞功能恢复的作用．视网膜完全缺血6O分钟后3O天分别记录闪光视网膜电图(FERG)和图型视网膜电图(PERG)，用甲苯酚染色评估缺血后视网膜节细眙的存活数目．每隔一天玻璃体内注入NGF，每次3O ，每周3次，共30
天．结果表明，NGF组对FERG 影响不明显．而视力、PERG，对比度闽值受到严重影响，PERG在低空间频率严重下降，高空间频率(1．6周／度)记录不到反应，视阿膜细胞数目减小，给予NGF后PERG 在所有幅值空间频率的下降幅度明显减小．在高空问频率t1．6周／度)可记录到反应．视力的对比度闰值、PVEP 可正常．视网膜节细胞数目增大，表明眼内注入NGF．可以促进视网膜节细胞的存活和功能的持久恢复．NGF这种保护作用的机制可能为NGF通过减少钙离子进入缺血后视阿膜神经元的细胞内．作者认为NGF可以作为一个全新的
治疗缺血性眼病的药物治疗手段，可以设想NGF对以下缺血性眼病有作用：视网膜中央动脉、中央静脉栓塞．视网膜分支动脉、静脉栓塞，低灌注压性视网膜病变．糖尿病性视网膜病变．缺血性视神经病变等．
(2)弱视
Berandi(1 991) 在小白鼠视皮层的实验中证实NGF 可以阻止单眼视觉剥夺后优势眼的分布，说明NGF可以预防鼠视觉剥夺对其视皮质的影响．Bomenici(1991) 发现在59只单眼剥夺性弱视小白鼠玻璃体腔内反复多次注射或眼局部应用NGF后，其视力、对比敏感度和视皮层结构可恢复正常，认为两只眼输入到双眼性视皮层神经元有竞争，这种竞争活动有神经营养因子参加．而视觉剥夺眼的视觉传人不足、双眼竞争者，是由于神经营养因子的不足．造成视觉传入突触的效率很低，而外源性NGF可以直接作用于视路神经元，保持从视觉剥夺眼到视皮层的功能性输入．Berandi(1993)在单眼视觉剥夺小白鼠的实验中观察税皮层和外膝体NGF治疗前后的变化，发现给予外源性NGF在视皮层完全可以防止其神经元的主视眼的分布的改变、视觉剥夺眼视力的丧失以及小蛋白免疫力(Parva—LI)的显著下降；在外膝体可以阻止视觉剥夺眼相应的外膝体细胞层神经元的萎缩．这表明NGF对外膝体视皮层通路的可塑性方面起作用 Carmingnoto(1993)在33只单眼视觉剥夺幼猫的实验中，通过一个泵管道系统反复给其玻
璃体腔注入从成年小白鼠颔下腺提纯出的βNGF．单位放电记录视皮层对正弦光栅的视觉诱发反应以及用苯酚视网膜铺片评估外膝体A和A1层的咆体大小，发现NGF治疗后视皮层双眼性神经元明显增多．外膝体剥夺眼细胞层萎缩减少，阻止剥夺眼的视力丧失，恢复双眼性功能联系．基于以上一系列实验，可以设想NGF对儿童弱视尤其是视觉剥夺性弱视有治疗价值．
(3)视网膜母细胞瘤
神经母细胞瘤如视网膜母细胞瘤是儿童常见的恶性肿瘤之一．临床上，半数以上神经母细胞瘤具有明显的N—myc癌基因扩增．而N—myc扩增对神经母细胞的分化具有阻滞作用，NGF可使某些神经母细咆分化成神经元细胞．可望应用NGF治疗视阿膜母细胞瘤 ．
(4)视神经炎症、外伤、萎缩
Carmingnoto(1989)认为NGF对视觉系统有作用．在视网膜水平上，NGF可以促进成年小白鼠视神经切断后视网膜节细胞的存活．McQuarfie(1982)认为在视神经挫伤后1周，如手术清创神经管，可解除视神经缺血，有助于视神经的再生；可恢复光感，但光感不能维持很长时间，如同时给予NGF．光感维持时间可延长．Trner(1979．1980．1981．1988) 对蝾螈和金鱼所作的一系列实验表明+在动物身上NGF可保持视网膜节细胞的存活，促进节细胞轴突的再生和视神经纤维的生长．基于以上的实验，可以设想NGF对于视网膜震荡、视神经挫伤、外伤性及青光眼性视神经萎缩可能有一定的治疗价值．
(5)眼球移植——人类的梦想
将来视网膜移植、视神经移植及眼球移植的成功，可能要建立在对视神经纤维及血管在显微解剖下对应缝合的基础上．而且需要用NGF或其他生长因子如成纤维生长因子及血管生长因子促使移植眼球血液循环重建及视功能恢复，移植的眼球才会具有正常眼球的功能；如眼球能够成功地移植．将会使许多盲人重见光明．这一点对人类及医学科学的发展是多么重要和迫切只
要眼科学家和神经科学家们不断地努力，这个梦想将来一定会实现．
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