【摘要】 目的 研究神经生长因子(NGF)对成年兔视神经夹伤后修复的影响。 方法 16只成年兔随机分成NGF组和对照组，每组8只兔。建立兔右眼视神经夹伤模型后分别将载有0．06 ml NGF(浓度：5×10 g／： ，NGF组)或等量磷酸盐缓冲液(PBS)(对照组)的组织工程化神经移植于视神经损伤处；并向右眼玻璃体腔内注入0．02 ml NGF(浓度：5×10～ g／L，NGF组)或等量PBS(对照组)。所有兔左眼为正常空白对照组。分别于夹伤后1 d、2周、8周进行闪光视觉诱发电位(FVEP)检查。夹伤后8周时作光学显微镜和电子显微镜检查观察视网膜神经节细胞(RGC)和视神经的改变，同时用计算机图像处理系统作视神经纤维计数。 结果 夹伤后2周时FVEP检查结果显示，NGF组伤眼与健眼FVEP幅值比为0．765±0．150，对照组为0．494±0．108，NGF组与对照组相比差异有统计学意义(尸<O．01)。夹伤后8周时NGF组伤眼与健眼FVEP幅值比为0．581±0．138，对照组为0．409±0．119，NGF组与对照组相比差异有统计学意义(p<O．05)。夹伤后8周时的光学显微镜和电子显微镜检查结果显示：NGF组RGC、视神经纤维的退变较对照组轻。夹伤后8周时NGF组和对照组视神经纤维计数分别为(10 955±608．7)、(7 898±608．8)根／mm ，两组间差异有统计学意义(P<0．001)。 结论 NGF能够在一定程度上增加RGC的存活，促进轴突的再生，因而对视神经夹伤后的修复、视功能的恢复具有一定的促进作用。
视神经夹伤后视网膜神经节细胞(RGC)因凋亡而死的观点已成为共识⋯ 。一旦RGC凋亡则视神经不能再生，最终将导致视功能的永久丧失。根据目前的研究，给予外源性神经营养因子可减少RGC的凋亡，促使RGC的存活和残留轴突的再生。神经生长因子(NGF)是否对RGC具有保护作用尚存在争议。我们通过建立兔视神经夹伤模型，采用向玻璃体腔内注入NGF、球后移植含有NGF的组织工程化神经的给药方式，从形态和功能两方面来探讨NGF对高等脊椎动物视神经损伤后修复的影响。
1 材料和方法
1．1 材料
神经生长因子(NGF)一p购自美国Biodesign公司。组织工程化神经(主要成分为壳聚糖和聚乙醇酸)(中国专利公开号：Z（01108208．9)由南通医学院分子神经科学研究所提供。
1．2 兔视神经夹伤模型制作
健康成年中国大耳白兔16只由南通医学院实验动物中心提供，体重2．5～3．0 kg，雌雄不限。实验前常规双眼前后节检查均无异常、闪光视觉诱发电位(FVEP)检查无异常。随机分为NGF组和对照组，每组8只兔。选每只兔的右眼为致伤眼。3％戊巴比妥钠按1 ml／kg的剂量经兔耳缘静脉注射麻醉动物后，沿角巩膜缘剪开9点至3点钟处的上方球结膜，分离筋膜囊，暴露上直肌和上斜肌。用斜视钩钩住这两条肌肉，将眼球向内下方牵引。分离筋膜囊后，暴露眼球缩肌。用虹膜恢复器向两侧分开眼球缩肌，避开睫状血管，必要时予棉签向鼻下方轻压眼球，即可见视神经。将NGF组兔在视神经距眼球后方5 mm 处用眼科蚊钳钳夹视神经(上紧3齿，维持10 s)后切开视神经鞘膜，并将含有0．06 ml NGF(浓度：5×10 g／L)的组织工程化神经固定于视神经损伤处，然后于颞上方角膜缘后2 mm在经瞳孔直视下向玻璃体腔内缓慢注入0．02 ml含有1／xg NGF的磷酸盐缓冲液(PBS)。将含0．06 ml PBS的组织工程化神经固定于对照组兔视神经损伤处，并向玻璃体腔内注入0．02 ml不含药物的PBS。所有兔的左眼为正常空白对照眼，以同样方法手术暴露，但不致伤视神经。待动物清醒后观察瞳孔对光反射，凡瞳孔直接对光反射消失，直径大于4 mm 者用于本实验。
1．3 FVEP检查
采用VETS一11视觉电生理检查系统(重庆医用设备厂)，在安静状态下行兔双眼FVEP检查。参数设置为全视野连续白光，刺激光强为4 cd／m ，背景光强为0 cd／m ，闪烁频率2 Hz，低频为0．1 Hz，高频为85Hz，叠加次数100次，放大倍数为10 K。作用电极置于耳根前缘连线的中点(Oz)，参考电极放在前额正中(Fz)，接地电极放置于耳根部。
1．4 标本取材方法
于手术后8周安乐致死动物后迅速摘下眼球(摘除的眼球包含长约8～10 mm 的球后视神经)。分别在NGF组和对照组中，各随机选取2只伤眼连同视神经送光学显微镜检查；每组剩下6只伤眼，将视神经离断后，所有视神经制作成电子显微镜标本，其中3只眼的视网膜制作成电子显微镜标本，另3只眼的视网膜制作成光学显微镜标本。再随机选取8只正常空白对照眼，2只送光学显微镜检查，6只送电子显微镜检查。
1．5 光学显微镜标本制作
眼球固定液(由95 酒精、蒸馏水、40 甲醛、冰醋酸按比例配制而成)固定24～72 h后，将眼球沿角膜顶点与视盘鼻侧缘的连线剖成两半球，再将颞侧半球开一小窗后进行酒精梯度脱水、包埋、切片(片厚5／xm，连续切片5～10张)、苏木素一伊红(HE)染色后在显微镜下观察、摄片。
1．6 电子显微镜标本制作
4 戊二醛固定后将视网膜及视神经在距球后2(损伤处近端)、7 mm 处(损伤处远端)，修成约1．0mm×1．5 mm大小的组织块，二甲砷酸钠缓冲液漂浮，1％锇酸后固定，酒精梯度脱水，Epon 812包埋、切片(片厚50～70 nm)，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，电子显微镜下观察、摄片。
1．7 视神经纤维计数
按电子显微镜标本制作方法固定、脱水、包埋、作视神经横断面(球后2 mm 处)的半薄切片，片厚约1／xm。0．1 甲苯胺蓝染色，用CMM一302T病理远程会诊工作站系统中由北京航空航天工业大学图像中心研制的计算机自动图像分析系统作神经纤维计数，每组计数6张切片，每张切片计数6个视野，取其平均数。
1．8 统计学处理
全部实验数据输入计算机，以SAS统计软件包处理，用单因素方差分析作统计分析。
2 结果
2．1 FVEP检查结果
正常兔P 波的波幅为：(13．24±1．71) V，P 波的波幅为：(10．13±3．39) V。视神经夹伤后首先导致Pz波波形平坦甚至消失，术后8周时，除NGF组有1只兔的P。波明显引出外，其余兔的P。波均为波形平坦甚至消失。伤后l d时，NGF组伤眼与健眼P。波幅值比为0．491± 0。065，对照组为0。517± 0．061。
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