【摘要】目的:探讨蛇毒神经生长因子(NGF) 对人肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法:采用噻唑蓝(MTT) 法、台盼蓝拒染法和集落形成作为观察指标,以NGF 5 ,10 ,15 ,20μg / ml 处理4 种人肿瘤细胞(人白血病细胞株K 562、人胰癌细胞株JF 305 ,人肺癌细胞株AGZY283a 和人胃癌细胞MG2803) ,选用不同作用时间,分别观察NGF 对上述细胞的影响。阿霉素(Adr) 为阳性对照药。结果:NGF 对4 种人肿瘤细胞均有细胞毒性作用,K562 和JF 305 比后两者显示出更好的量效关系( P 均< 0. 05) 。NGF 处理24 ,48 和96 h 后K 562 和JF 305 细胞的生长均受到抑制( P < 0.05 , P < 0. 01) 。并有显著的剂量效应关系。处理JF 305 细胞24 ,48 和96 h ,NGF 的半抑制浓度( IC50) ,时间2效应关系亦明显;NGF 对K562 细胞的生长抑制作用以48 h 为显著。NGF 还可显著抑制JF 305 细胞的集落形成,并有明显的量效关系( P < 0. 01) ,其IC50为12. 86μg/ ml 。
结论:NGF 对4 种人肿瘤细胞均具有细胞毒性和生长抑制作用,对K562、JF 305 作用更显著。
肿瘤是危害人类健康的严重疾病,近年来,利用我国动物资源开发新的抗肿瘤药物,成为肿瘤研究领域的重要内容。蛇毒神经生长因子(nerve growthfactor , NGF) 抑瘤作用,国内尚未见报道。我们观察蛇毒抗肿瘤有效成分对4 种人肿瘤细胞的作用,报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
细胞:人白血病细胞株K 562 ,人胰癌细胞株JF 305 , 人肺癌细胞株AGZY283a ,人胃癌细胞株MG2803。除K 562 细胞为悬浮生长,其余3 种细胞均贴壁生长,培养于含5 %胎牛血清的RPMI 1640 培养基中(内含青霉素100 u/ ml ,链霉素100 u/ ml) 。细胞在含5 % CO2 的37 ℃培养箱中培养,每2 d 传一代,细胞株由本实验室提供。
药品与试剂:NGF 的分离采用常规层析方法进行分离,高效液相色谱(HPLC) 法分析检测蛇毒的分离效果,经冷冻干燥后- 30 ℃保存,实验前用生理盐水稀释成所需浓度。盐酸阿霉素(adriamycin ,Adr)为意大利普强公司生产市售冻干粉剂,使用前用RPMI 1640 稀释。
细胞毒实验:采用噻唑蓝(MTT) 法[1 ] 。贴壁生长的肿瘤细胞经胰蛋白酶消化后,制成含细胞1.0 ×105/ ml 单细胞悬液,分别接种于无菌96 孔培养板中,每孔反应总体积200μl ,设空白对照组(加等体积RPMI 1640) 、阳性对照和NGF 组,每组4 个重复孔。NGF 处理MG2803、AGZY283a 、JF 305 和K 562细胞时选用4 个浓度5 ,10 ,15 ,20 μg/ ml ,Adr (0. 25μg/ ml) 为阳性对照,细胞置37 ℃培养48 h。实验终止前4 h 加入MTT 20μl (5 mg/ ml) 继续培养4 h ,弃上清液,加入二甲基亚砜(DMSO) 100μl/ 孔,用酶标仪于波长570 nm 处测定A570值,按下列公式求出生长抑制率( IR) :IR( %) = (1 - 用药组A570值/ 对照组A570值) ×100
生长抑制实验:采用台盼蓝拒染法。4 种肿瘤细胞实验分组及给药浓度同细胞毒性实验。NGF处理细胞24 ,48 ,96 h 计数拒染活细胞数,计算IR 和半抑制浓度( IC50) 。
集落形成实验:按文献[ 2 ]方法取JF 305 细胞每孔1 ml (600 cells/ ml) ,接种于12 孔板,每孔再加入1ml 培养液,实验分组及给药浓度同细胞毒实验。于37 ℃,5 % CO2 温箱中静置培养24 h 后,各组加入相应药物,培养4 h ,用D2Hank 液洗3 遍,更换新鲜培养液(2 ml/ 孔) 静置培养7～10 d。在×20 解剖镜下计数含50 个细胞以上的集落,计算集落形成抑制率( IR) 及IC50 。
统计学分析 OD 值采用F 检验和q 检验,集落形成采用χ2 检验,将细胞数与OD 值、剂量效应做直线回归与相关性分析,相关系数用t 检验。
2 结果
2.1 NGF对人肿瘤细胞的毒性作用 NGF 处理4种肿瘤细胞后,细胞代谢MTT 的能力下降,细胞毒性反应明显。其对AGZY283a 、MG2803 细胞毒性的剂量效应关系不明显,NGF 对K 562 ,JF 05 两种细胞显示出更好的剂量效应关系,相关系数r 分别为0. 9726 和0. 9768 ( P 均< 0. 05) , IC50分别为12. 64μg/ ml 和12. 68μg/ ml ,见表1。
2.2 NGF对人肿瘤细胞生长抑制作用 K 562 ,JF305 细胞经NGF 处理24 ,48 ,96 h 后,生长明显受抑制,剂量效应关系显著,相关系数r 在24 ,48 和96 h分别为0. 9823 ,0. 9726 ,0. 9789 和0. 9769 ,0. 9836 ,0.9806 ( P均< 0. 05) 。IC50分别为17. 89 ,10. 60 ,13. 42μg/ ml 和18. 25 ,4. 36 ,9. 10μg/ ml 。对K 562 细胞的生长抑制作用以48 h 为显著,96 h 时效应不增强,JF305 细胞生长抑制效应随NGF 作用时间的延长而增强。见表2(略)。
2. 3 NGF 对JF 305 细胞集落形成抑制作用 NGF浓度> 10μg/ ml 时,JF 305 细胞的集落的形成能力明显降低( P < 0. 01) 。IR 随NGF 浓度的增高而升高,直线回归方程为Y = - 0. 026 + 0. 046 X ( r =0. 9808 , P < 0. 05) ,剂量效应关系显著,IC50为12. 86μg/ ml 。见表3(略)。
3 讨论
在抗肿瘤药物筛选和研究中,体外肿瘤细胞培养和动物实验居重要地位[2 ] 。采用体外细胞培养方法筛选抗肿瘤药物时,检测的终点指标包括细胞的生存能力和生长能力检测两个方面,前者的检测常采用MTT 法,后者的检测常采用集落形成能力实验、细胞计数、蛋白质或其它大分子物质含量测定等。两者结合能客观地反应被测物质的药理作用。本实验应用4 种人肿瘤细胞系采用体外培养的方法,全面观察NGF 的抗肿瘤作用。国外已报道NGF对一些神经和非神经肿瘤,如前列腺癌、肺癌、乳腺癌的抗肿瘤作用。结果显示NGF 可发挥抑制有丝分裂和生长作用(依赖于细胞类型) 。例如NGF 诱导肿瘤细胞生长和侵入,而在人类小细胞癌,NGF 可抑制癌细胞的增殖,阻止它们的克隆生长,在体外可削弱它们的入侵能力,在裸鼠则消除其肿瘤生长能力[3～6 ] ,有报道认为,NGF 可以抑制一些胰癌细胞系的入侵[7 ] 。本实验结果表明,NGF 在所用剂量范围内(5～20μg/ ml) 对MG2803 ,AGZY283a 、JF 305、K 562细胞均有细胞毒作用,细胞经NGF 处理后活细胞数减少,代谢MTT的能力下降,细胞生长受到抑制,克隆形成能力下降。并显示与NGF 的浓度和作用时间均有依赖性,说明NGF 具有一定的抗肿瘤作用。
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